iElisa 赭曲霉毒素 A 檢測試劑盒 

iElisa 赭曲霉毒素 A 檢測試劑盒 

1. 概要 赭曲霉毒素Ａ由 Aspergillus 和 Penicillium 兩類霉菌產生，除明顯的腎毒性外，赭曲霉毒素 A 還表現出肝毒性、致畸性、致癌性和免疫抑制性等 特性。對人體健康而言，危害不僅來源于污染的植 物性食品，也通過動物性食品的攝入。我國規定谷 物、豆類及其制品中赭曲霉毒素A不得超過5μg/kg， 歐盟規定谷物、豆類及其制品中赭曲霉毒素 A 不得 超過 3μg/kg。 2. 原理 測定的基礎是抗原-抗體反應。微孔板上包被有 抗抗體。加入赭曲霉毒素 A（OTA）標準品或樣品、 酶標抗原和抗體后，游離的赭曲霉毒素 A 與酶標抗 原競爭結合抗體，抗體或抗體結合物與固定在微孔 板上的抗抗體再結合，沒有結合的標準品、酶標抗 原及抗體被洗去，加入 TMB 底物顯藍色，加入終 止液后顏色由藍變黃，用酶標儀在 450nm 處檢測， 吸光值與樣品中赭曲霉毒素 A 含量成負相關，與標 準曲線比較即可得出赭曲霉毒素 A 的含量。 3. 試劑盒組成 1) 包被有抗抗體的96微孔板：1塊（96孔，12條×8 孔） 2) 赭曲霉標準品：0 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、 1.0 ppb、 2.0 ppb、5.0 ppb 1 瓶 × 1.0ml 3) OTA抗體： 1 瓶 × 10ml 4) OTA酶標抗原： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 濃縮洗滌液： 1 瓶 × 50ml 6) OTA稀釋緩沖液： 1 瓶 ×50ml 7) 顯色底物液： 1 瓶 ×17ml 8) 反應終止液： 1 瓶 × 7ml 9) 試劑盒說明書 10) 質檢報告 4. 需要的儀器、試劑 1）儀器 —酶標儀 450nm（iElisa 全自動酶標儀或相當者） —微量移液器：20μl-200μl 單道，100μl-1000μl 單道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋轉混合器（或者搖床、高速均質器） —酶標板振蕩器 —渦旋混合器 —50ml 離心管 —1.5ml 離心管 —定性濾紙 —過濾漏斗 —天平：感量 0.01g 2）試劑 —樣品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 純水，混勻。 —純水（蒸餾水、去離子水） 5. 樣品處理 5.1 谷物（玉米、小麥、大麥、大米、大豆）： 1） 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2） 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 200μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 200μl OTA 稀釋緩沖 液，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數：10 5.2 飼料： 1) 稱取 5.0g 粉碎樣品于 50ml 離心管中，加入 25.0ml 樣品提取液 70%甲醇,置于多功能旋轉 混合器上振蕩 10 分鐘（或使用高速均質器均 質 3 分鐘，或搖床上振蕩 40 分鐘）。 2) 將提取液用普通濾紙過濾，吸取 100μl 濾液置 于 1.5ml 離心管中，加入 400μl OTA 稀釋緩沖 液，用渦旋混合器混勻。 稀釋倍數：25 5.3 尿液樣品： 1) 取 5ml 待檢樣品于 15ml 離心管中，3000r/min， 離心 10 分鐘2) 吸取 100μl 離心后澄清樣品置于 1.5ml 離心管 中 3) 加入 400μl OTA 稀釋緩沖液，用渦旋混合器混 勻。 稀釋倍數：5 6.酶聯免疫分析程序 6.1 測定之前注意事項 1) 使用前將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）。 2) 使用后迅速將試劑放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再現性，很大程度上取決于 洗板的*性，正確的洗板操作是 ELISA 測定 程序中的要點。 4) 所有孵育過程應避免陽光直射，并按要求用蓋 板覆蓋住酶標板。 6.2 溶液的配制 1） 提取液的配制: 根據實驗所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用純水、或蒸餾水、去離子 水） 2） 洗滌液的配制：將濃縮洗滌液用去離子水稀釋 10 倍后使用（1 份濃縮洗滌液加 9 份蒸餾水）。 6.3 測定程序 1) 將足夠標準品和樣品所用數量的孔條插入酶 標板架，標準品和樣品做兩個平行實驗，記錄 下標準和樣品的位置。未使用的酶標板用鋁箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 分別吸取 50μl 標準品和樣品加至相應的微孔 （雙孔）中，然后各加入 50μl 酶標抗原，再 加入 50μl 抗體，加蓋，在室溫反應 40min（每 個標準和樣品必須使用新的吸頭）。 3) 倒出孔中的液體，將微孔架倒置在吸水紙上拍 打以保證*除去孔中的液體，然后每孔加入 250μl 稀釋好的洗滌液洗滌，振蕩后倒出孔中 的液體，拍干；重復操作四次，洗板時每次間 隔20s，洗完后用力在吸水紙上排干。 4) 每孔加入150μl底物， 室溫避光溫育15min。 5) 每孔加入50μl 反應終止液，混勻。 6) 置于酶標儀中，振蕩混勻，在450nm處測定吸 光度值（OD值），參比波長630nm。（iElisa全 自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值）。 7. 結果判定 1) 所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值 的平均值（B）除以*個標準（0 標準）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以赭曲霉毒素 A 標準品濃度值（ppb）為 X 軸， 百分吸光度值為 Y 軸，繪制標準曲線圖。相對應每 一個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出。也可以用 回歸方程法，計算出樣本溶液濃度。利用計算機專 業軟件，更便于大量樣品的快速分析。 2） 樣品的實際濃度為讀數結果乘以相應的稀釋倍 數。 3） 如果測定值超出檢測范圍，樣品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇進行稀釋。 8. 注意事項 1) 室溫低于20℃或試劑及標本未回到室溫（20- 25℃）會導致數值偏低。 2) 在洗板過程中如果出現板孔干燥過久的情況， 則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現 象。所以洗板排干后應立即進行下一步操作。 3) 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在 光線下。 4) 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準 液的時候都必需充分混合均勻）。 5) 反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。 6) 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或 攙雜使用不同生產廠家的試劑盒這樣會引起 靈敏度降低。 7) 試劑盒的儲存條件是2-8℃，切勿冷凍。 9. 檢測方法靈敏度、準確度、精密度 1) 檢測限 LOD: 谷物 1ppb（μg /kg），飼料 2.5ppb 尿液 1.0。（LOD：空白樣品測定值+2 倍標準偏 差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 2ppb，飼料 5ppb,尿液 1.5ppb。 3) 定量檢測范圍：谷物 2-50ppb，飼料 5-125ppb, 飼料 1.5-25ppb。